Lors du processus de purification des protéines, plusieurs points doivent être pris en compte. Premièrement, la valeur du pH doit être contrôlée tout au long du processus de purification pour éviter les changements conformationnels irréversibles des protéines en raison d'une acidité ou d'une alcalinité excessive. La solution tampon doit avoir la bonne valeur du pH et être inoffensive pour les protéines. Lors de la purification des protéines à partir de plantes et de champignons, une capacité tampon plus importante est généralement requise. À ce moment, il faut prêter attention à la concentration de la solution tampon, ainsi qu'à l'appropriation des composants de la solution tampon et à la possibilité qu'ils entraînent des réactions secondaires, etc. Les protéines contenant des groupes sulfhydryles libres (lorsque les groupes sulfhydryles ne sont pas liés en ponts disulfures) sont particulièrement sujettes à l'oxydation. Par conséquent, un environnement réducteur doit être maintenu. Certains agents réducteurs contenant des groupes sulfhydryles peuvent être ajoutés et l'ensemble du système doit être maintenu dans un état exempt d'oxygène pour résoudre ce problème. Cependant, dans certains cas, les composés sulfhydryles ajoutés peuvent inhiber l'activité de la protéine. Durant le processus de purification, il est généralement nécessaire de maintenir une basse température car il existe des enzymes protéolytiques dans les cellules, qui sont activées après l'homogénéisation tissulaire et peuvent dégrader les protéines.
Par conséquent, une basse température doit être maintenue pour réduire l'activité des enzymes protéolytiques. Cependant, il faut noter que parfois les basses températures peuvent également détruire la structure quaternaire de certaines enzymes. En général, les protéines sont relativement stables à 0 °C, mais l'acétone carboxylase est sensible au froid et est stable à 25 °C. Certaines enzymes nécessitent - 20 °C ou - 70 °C pour maintenir leur activité.
Un des plus grands problèmes de la purification des protéines est que les protéines sont inévitablement exposées à des environnements de solution très différents de leur état physiologique tout au long du processus de purification. Cela est particulièrement significatif pour les protéines dont les fonctions sont fortement régulées dans les cellules vivantes. En revanche, certaines protéines, telles que les protéines de sécrétion, peuvent s'adapter à des changements environnementaux importants sans altérer leur structure ou leur fonction. Pour réduire la dénaturation spontanée des protéines dans les solutions aqueuses diluées, des substances à petites molécules (telles que le sucrose, le glycérol, etc.) ou d'autres protéines (telles que l'albumine de sérum bovin, la gélatine, etc.) peuvent être ajoutées à la solution de protéines pour stabiliser les protéines. C'est une méthode qui imite l'environnement intracellulaire et peut réduire les effets nocifs de l'eau. C'est également la raison pourquoi l'albumine est ajoutée en tant que stabilisant dans de nombreux médicaments à base de protéines génétiques. Parfois, même du diméthylsulfoxyde, du diméthylformamide, etc. sont ajoutés, et la concentration doit être testée, généralement comprise entre 1 % et 10 %. Quelques protéines peuvent maintenir leur activité dans des milieux polaires à force ionique élevée, tels que le KCl, le NaCl, le (NH₄)₂SO₄, etc.
En outre, il existe quelques méthodes couramment utilisées qui peuvent réduire efficacement la dénaturation des protéines. Par exemple, la présence de certains ions divalents (tels que Mg²⁺, Ca²⁺, etc.) peut aider à stabiliser les protéines ou les complexes protéiques ; lors de la purification d'enzymes, des substrats spécifiques peuvent être ajoutés ; parfois des agents chélatants (tels que l'éthylènediaminetétraacétate) sont utilisés pour éliminer les ions indésirables, en particulier les ions métalliques nocifs apportés par les sources d'eau. Ces méthodes peuvent être utilisées en fonction de la situation spécifique. Un autre facteur à noter est que même avec une grande précision lors du processus de purification, les protéines peuvent subir des changements structurels. Par conséquent, même si l'activité de la protéine purifiée est en grande partie conservée, sa conformation peut différer de la conformation naturelle ou de la conformation avec une fonction complète. Dans de tels cas, les propriétés de la protéine mesurées in vitro peuvent ne pas refléter précisément les caractéristiques de ces macromolécules. La dissociation des protéines contenant plusieurs sous - unités est un type spécial de dénaturation. Lors de la purification des protéines, lorsque l'activité mesurée est exprimée par seulement un type de sous - unité, d'autres sous - unités peuvent être perdues parce qu'elles ne sont pas remarquées. Certaines protéines ont une forme multifonctionnelle dans l'organisme, et leur activité biologique est affichée par deux ou plusieurs protéines déterminées par différents gènes. Il faut être prudent lorsqu'on infère la fonction biologique complète de la protéine purifiée à partir de ses propriétés. Il est utile d'analyser l'activité globale lors du processus de purification. Au début du processus de purification, si la vitalité totale est utilisée comme repère, on espère que 50 % de la vitalité totale peut être récupérée à la fin de la purification, mais le rendement réel obtenu est souvent seulement de 5 % - 20 %. Dans certains cas, en particulier lorsque de grandes quantités de matières premières sont disponibles, on peut se concentrer sur l'obtention d'un échantillon à activité spécifique élevée sans s'inquiéter du rendement.