Le réservoir de semences de l'atelier utilise la technologie de culture liquide profonde pour assurer une propagation et une activation efficaces des micro-organismes, de petites à grandes quantités et du stade du laboratoire au stade de la production industrielle, fournissant une quantité suffisante et une activité appropriée de semences pour la production par fermentation et assurant le bon déroulement du processus de fermentation.
La préparation des semences en atelier de production est généralement appelée préparation de la culture végétative (ou préparation mycélienne). Cette culture végétative est une culture en milieu liquide immergé dans la cuve de semences. Son objectif est de permettre à la quantité limitée de mycélium contenue dans le flacon d'inoculum de se développer et de se multiplier en un grand nombre de cellules végétatives, réduisant ainsi le temps de propagation en fermenteur. La préparation des semences est réalisée dans la cuve de semences par culture liquide immergée.
Les spores ou le mycélium préparés en laboratoire sont transférés dans une cuve d'ensemencement pour la culture à grande échelle. Bien que le milieu de culture dans cette cuve varie selon la souche, le principe consiste à utiliser des composants facilement assimilables par le mycélium, tels que le glucose, le jus de trempage de maïs et le phosphate. Parallèlement, un apport suffisant d'air stérile et une agitation continue du milieu sont indispensables pour garantir une répartition homogène du mycélium et des conditions de culture identiques.
Il existe plusieurs méthodes d'inoculation pour les cuves de semis. Les suspensions de spores sont généralement inoculées par la méthode d'inoculation par micropores. Pour l'inoculation par culture végétative en flacon agité, la cuve de semis peut être connectée sous protection de flamme ou par la méthode de pression différentielle. La principale méthode de transfert des semences entre cuves ou fermenteurs est la méthode de pression différentielle, à l'aide de tuyaux de transfert. Lors du transfert, il est crucial d'éviter toute chute de pression à zéro dans la cuve de réception, sous peine de contamination.
La préparation des semences est un processus d'extrapolation par étapes, dont le nombre varie selon la variété du produit. On distingue généralement les étapes de préparation primaire, secondaire et tertiaire. Pourquoi une extrapolation par étapes est-elle nécessaire ? Parce que le nombre de spores et de mycéliums préparés en laboratoire est limité. Inoculer directement une petite quantité d'inoculum dans un fermenteur de plusieurs dizaines de mètres cubes entraînerait une période de croissance très longue, prolongeant ainsi le cycle improductif du fermenteur, ce qui serait non rentable. De plus, compte tenu des caractéristiques de croissance des micro-organismes, un inoculum trop petit peut conduire à une faible croissance mycélienne ou à la formation d'amas mycéliens, affectant la synthèse du produit. C'est pourquoi, sur la base de l'expérience pratique, on adopte une méthode d'extrapolation par étapes.
Le nombre d'étapes dépend des caractéristiques de croissance de la souche bactérienne, du taux de germination des spores et de reproduction cellulaire, ainsi que du volume du fermenteur utilisé. Pour les bactéries à croissance rapide, la quantité de culture de départ est relativement faible, et le nombre d'étapes est donc réduit. Par exemple, pour la production d'acide glutamique, les bactéries sont ensemencées dans une cuve de pré-ensemencement à l'aide d'un milieu de culture incliné en flacon d'aubergine ou d'un flacon agité, puis incubées à 32 °C pendant 7 à 10 heures, jusqu'à ce que la concentration bactérienne atteigne 10⁸ à 10⁹ cellules/mL. Cette culture est ensuite introduite dans le fermenteur comme culture de départ, appelée culture d'expansion primaire. La fermentation réalisée à partir de cette culture de départ primaire est appelée fermentation secondaire. Pour les souches à croissance plus lente, comme les souches productrices de pénicilline, leur suspension de spores est ensemencée dans une cuve de pré-ensemencement primaire et incubée à 25 °C pendant 40 heures. Durant cette période, les spores germent et le mycélium se développe. Ensuite, les cellules sont transférées dans un réservoir d'ensemencement secondaire contenant un milieu de culture frais et incubées à 27 °C pendant 15 à 24 heures. Le mycélium se multiplie rapidement, produisant des cellules robustes. Ce mycélium peut alors être transféré dans le fermenteur comme culture d'ensemencement, une étape appelée culture d'expansion en réservoir d'ensemencement secondaire, suivie d'une fermentation tertiaire. Généralement, un fermenteur de 50 m³ utilise la fermentation tertiaire. Pour les souches à croissance plus lente, telles que *Streptomyces griseus*, un réservoir d'ensemencement à trois étages est généralement utilisé pour la culture à grande échelle. Dans les expériences menées dans de petits fermenteurs (5 à 30 L), l'inoculation directe de spores ou de mycélium dans le réservoir de fermentation est également parfois utilisée ; on parle alors de fermentation primaire.
La réduction du nombre d'étapes de cuve d'ensemencement simplifie le processus et son contrôle, diminuant ainsi le risque de contamination lors de transferts multiples. Toutefois, pour optimiser l'efficacité de la fermentation, il est essentiel de tenir compte des caractéristiques de chaque souche de production et de la configuration des équipements de l'atelier. Si le nombre d'étapes de cuve d'ensemencement dépend de la variété du produit et de l'échelle de production, il est également lié aux conditions de procédé choisies. Par exemple, modifier les conditions de culture dans la cuve d'ensemencement afin d'accélérer la germination des spores et la multiplication mycélienne permet de réduire d'autant le nombre d'étapes.