Технология микробной ферментации имеет широкий спектр применения, а посевное культивирование является важнейшим предварительным этапом ферментации, напрямую влияющим на эффективность и выход продукта. Питательная среда, температура, возраст и размер посевного материала, аэрация и перемешивание, а также баланс растворенного кислорода и БПК — все это ключевые факторы, регулирующие качество посевного материала. В данной статье изложены механизмы действия и ключевые точки контроля этих факторов, что служит ориентиром для оптимизации процессов посевного культивирования и повышения эффективности ферментации.
Питательные среды играют решающую роль в усвоении питательных веществ и напрямую влияют на рост, размножение, активность ферментов и урожайность микроорганизмов. Питательные среды можно разделить на три категории: питательные вещества, обеспечивающие основной рост (соотношение C/N), неорганические соли, регулирующие осмотическое давление, компоненты, поддерживающие содержание микроэлементов, и системы регулирования pH/активности ферментов.
Питательная среда для семян является основной средой для роста и размножения семян, обеспечивая микроорганизмы необходимыми питательными веществами, источниками энергии и подходящими физико-химическими условиями.
Во-первых, достаточное и сбалансированное питание является ключевым фактором обеспечения жизнеспособности и количества семян. Например, источники углерода являются энергетической основой для роста микроорганизмов, а источники азота — важными компонентами клеточного вещества. Если запасы углерода или азота недостаточны, рост семян будет замедлен, и ожидаемое количество и качество не будут достигнуты.
Неорганические соли в культуральной среде, такие как фосфор, сера, магний и калий, играют незаменимую роль в поддержании баланса осмотического давления, активности ферментов и структурной целостности клеток. Например, фосфор участвует в синтезе нуклеиновых кислот и фосфолипидов. Недостаток фосфора препятствует репликации генетического материала и формированию клеточной мембраны, что влияет на рост и размножение семян.
Чистота и содержание примесей в сырье для питательных сред могут влиять на рост микроорганизмов. Если сырье содержит токсичные вещества или ингибиторы, оно может оказывать токсическое воздействие на рост семян и даже приводить к их гибели.
A. Конечная питательная среда в затравочном резервуаре должна быть такой же, как и в производственном резервуаре. На этом этапе ферментативная система, необходимая для ферментации, уже сформирована в предыдущем резервуаре, и ее не нужно перестраивать в новых условиях окружающей среды.
B. Долю источника азота в питательной среде для посевного резервуара следует увеличить, при этом увеличение доли неорганического азота должно быть более значительным.
C. После модернизации штамма, из-за различий в оборудовании (тип резервуара, способ перемешивания, скорость и т. д.), необходимо скорректировать соотношение компонентов культуральной среды в соответствии с условиями эксперимента.
В биологии температура является одним из ключевых факторов окружающей среды для роста микроорганизмов, существенно влияя на скорость их роста и метаболическую активность. Как правило, при каждом повышении температуры на 10 °C скорость роста микроорганизмов удваивается, главным образом потому, что температура напрямую влияет на внутриклеточную систему метаболических ферментов.
Ферменты — это белки, которые катализируют химические реакции в живых организмах, и рост и метаболизм микроорганизмов почти полностью катализируются ферментами. Скорость реакции ферментов в значительной степени зависит от температуры, и существует оптимальный температурный диапазон, в котором активность ферментов максимальна, а рост и метаболизм микроорганизмов также происходят быстрее всего.
При температуре ниже оптимальной активность ферментов снижается, и скорость роста микроорганизмов замедляется; при температуре выше оптимальной ферменты могут терять свою активность из-за денатурации, что приводит к замедлению роста или даже гибели микроорганизмов.
Уровень растворенного кислорода в ферментационной системе определяется скоростью аэрации, давлением в резервуаре и условиями перемешивания. Клетки-семена могут нормально расти только тогда, когда содержание растворенного кислорода (ДО) в ферментационной среде выше текущей биологической потребности в кислороде (БПК) системы. После пересадки клеток-семен они быстро переходят в логарифмическую фазу роста, с экспоненциальным увеличением скорости деления и размножения. На этом этапе скорость аэрации и мощность перемешивания обычно регулируются попеременно для поддержания уровня растворенного кислорода, необходимого для роста клеток. Если регулировки аэрации и перемешивания недостаточны для удовлетворения потребления кислорода клетками, температуру культивирования можно соответствующим образом снизить, чтобы замедлить скорость потребления кислорода. Эта операция немного снизит эффективность деления и роста клеток, но эффективно предотвратит деформации клеток и автолиз из-за дефицита кислорода, обеспечивая нормальный клеточный метаболизм и выживание.
Аэрация напрямую восполняет источник растворенного кислорода в ферментационной системе за счет непрерывной подачи свежего воздуха в ферментер. Перемешивание способствует тщательному перемешиванию газов, жидкостей и твердых частиц в ферментационной среде, эффективно улучшая равномерность распределения растворенного кислорода и эффективность массопереноса газ-жидкость. Путем попеременной регулировки скорости аэрации и мощности перемешивания можно добиться точного контроля уровня растворенного кислорода в ферментационной системе. В фазе интенсивного роста клеток одновременное увеличение скорости аэрации и мощности перемешивания может значительно повысить уровень растворенного кислорода, полностью удовлетворяя потребности в кислороде для быстрого размножения клеток. При избытке или недостатке растворенного кислорода в системе эти два параметра можно гибко регулировать для поддержания стабильной среды растворенного кислорода в ферментационной системе, обеспечивая непрерывный и стабильный рост и метаболизм клеток.
Биологическая потребность в кислороде (БПК) является важным показателем степени органического загрязнения водоемов, напрямую отражающим общее количество кислорода, необходимое для разложения органических веществ микроорганизмами. В процессе ферментации баланс между растворенным кислородом (ДО) и БПК имеет решающее значение для нормального роста микроорганизмов. Только когда содержание растворенного кислорода (ДО) превышает текущее значение БПК, микроорганизмы могут поддерживать нормальный рост и метаболическую активность. Если содержание растворенного кислорода ниже БПК, система будет испытывать гипоксический стресс, подавляя физиологический метаболизм микроорганизмов, что приведет к снижению скорости роста клеток, уменьшению накопления метаболитов, а в тяжелых случаях — к аутолизу клеток, что приведет к нарушению ферментации.
Молодые культуры, из-за недостаточного роста и зрелости, а также неполного формирования внутриклеточных ферментных систем и метаболических механизмов, хуже адаптируются к новой среде после переноса в бродильный резервуар, что приводит к медленному запуску процесса. Более старые культуры, с другой стороны, также могут плохо функционировать в новой среде из-за снижения жизнеспособности клеток и метаболического упадка. Обе ситуации приведут к увеличению цикла ферментации, росту производственных затрат и, в конечном итоге, к снижению выхода продукции.
При большом размере инокулята клеточное деление и пролиферация сопровождаются обилием метаболитов, таких как РНК. Эти метаболиты могут быстро поддерживать рост и размножение клеток в новой среде, позволяя клеткам быстро перейти в фазу логарифмического роста и сокращая время, необходимое для адаптации к новой среде.
И наоборот, если размер инокулята слишком мал, количество метаболитов внутри клеток будет недостаточным, и клеткам потребуется больше времени для синтеза необходимых веществ, что приведет к увеличению лаг-фазы. В качестве примера рассмотрим дрожжевое брожение для производства спирта: при недостаточном размере инокулята скорость производства спирта на ранних стадиях брожения значительно замедлится, что приведет к увеличению цикла брожения и снижению эффективности производства.