1. Это процесс естественного отбора бактериальных клеток.
Естественный отбор — это процесс отбора превосходных штаммов посредством спонтанных мутаций в процессе производства, без искусственного вмешательства. Спонтанные мутации в штаммах часто предоставляют две возможности: дегенерацию штамма, приводящую к снижению продуктивности, или повышение метаболической активности, приводящее к улучшению продуктивности. Опытные и внимательные специалисты могут использовать эти изменения фенотипических признаков для отбора превосходных штаммов. Например, при ферментации глутаминовой кислоты из ферментационной среды, загрязненной бактериофагами, были выделены фагоустойчивые штаммы. Аналогично, при ферментации антибиотиков отбор проб из высокоурожайной партии ферментационной среды часто позволяет получить относительно стабильные, высокоурожайные штаммы. Однако частота спонтанных мутаций низка, и вероятность развития превосходных признаков невелика; для достижения результатов требуется значительный период времени.
2. Это селекция, основанная на мутагенезе бактериальных клеток.
Мутационная селекция подразумевает искусственную обработку микроорганизмов для индукции мутаций с последующим отбором мутантных штаммов, отвечающих определенным требованиям для производства и научных экспериментов. По сравнению с другими методами селекции, мутационная селекция обладает преимуществами простоты в применении, скорости и высокой эффективности, и остается важным и широко используемым методом микробной селекции. Мутационная селекция состоит из трех частей: отбор исходного штамма, мутагенная обработка и отбор мутантных штаммов.
После мутагенеза бактериальные штаммы могут продуцировать различные мутантные типы. Как отобрать желаемый мутантный тип? Обычно это включает два этапа: первичный скрининг и вторичный скрининг. Следующий пример иллюстрирует скрининг высокопродуктивных мутантных штаммов пенициллинпродуцирующих бактерий. Раствор мутантных бактерий разбавляют до определенной концентрации и высевают на агаровые пластины. После инкубации отдельные колонии переносят на скошенные агаровые пластины. После дальнейшей инкубации каждую колонию на скошенной пластине инокулируют в колбу для встряхивания, встряхивают, а затем измеряют титр антибиотика. Это первичный скрининг. Штаммы с титром, превышающим контрольный более чем на 10% по сравнению с первичным скринингом, затем подвергаются вторичному скринингу. Процесс вторичного скрининга в основном такой же, как и первичный, за исключением того, что каждую отдельную колонию на скошенной пластине обычно инокулируют в три колбы для встряхивания, чтобы получить средний титр. Вторичный скрининг можно проводить от 1 до 3 раз. Высокопродуктивные стабильные штаммы, отобранные таким образом, все же должны пройти испытания в малых и средних масштабах, прежде чем их можно будет использовать в ферментативном производстве.
1. Сырье: источник углерода, источник азота, фактор роста, неорганическая соль и вода.
2. Принципы: Цель должна быть ясна, питание должно быть скоординировано, а уровень pH должен быть соответствующим.
Процесс ферментации должен быть свободен от загрязнения другими микроорганизмами. Это требует стерилизации не только питательной среды, но и ферментационного оборудования, а также подаваемого воздуха. Стерилизация должна уничтожать не только клетки других микроорганизмов, но и споры и эндоспоры.
Расширение культуры может сократить период адаптации для роста микроорганизмов.
Это центральный этап ферментации. Ключевым моментом является контроль условий ферментации, таких как температура, pH, растворенный кислород, скорость аэрации и скорость вращения. Это связано с тем, что изменения условий окружающей среды влияют не только на рост и размножение микроорганизмов, но и на образование их метаболических продуктов. Факторы, влияющие на процесс ферментации, в основном включают следующие аспекты.
1. Контроль температуры
Температура оказывает многогранное воздействие на микроорганизмы. Во-первых, она влияет на активность ферментов. В оптимальном температурном диапазоне с повышением температуры ускоряется рост клеток и метаболизм, а также скорость реакции брожения. За пределами оптимального температурного диапазона ферменты быстро становятся неактивными, клетки стареют, цикл брожения сокращается, а выход продукта снижается. Температура также влияет на биосинтетические пути. Например, *Streptomyces aureus* обладает высокой способностью синтезировать хлортетрациклин при температуре ниже 30°C, но при температуре выше 35°C он синтезирует только тетрациклин, а не хлортетрациклин. Кроме того, температура влияет на физические свойства ферментационной среды, а также на разложение и усвоение питательных веществ микроорганизмами. Поэтому поддержание оптимальной температуры имеет решающее значение для нормального процесса брожения. Однако оптимальные температуры для роста клеток и синтеза продукта не обязательно совпадают. Например, оптимальная температура роста для *Streptomyces griseus* составляет 37°C, а оптимальная температура для производства антибиотиков — 28°C. Как правило, необходимо экспериментальным путем определить оптимальную температуру для каждой стадии ферментации различных микроорганизмов и внедрить сегментированный контроль.
2. Подходящее значение pH
pH влияет на активность ферментов и заряд клеточных мембран. Изменения заряда клеточной мембраны изменяют ее проницаемость, потенциально влияя на усвоение питательных веществ и секрецию метаболических продуктов микроорганизмами. Кроме того, pH влияет на разложение питательных веществ в культуральной среде. Поэтому необходимо контролировать pH ферментационной среды. Однако оптимальный pH варьируется в зависимости от стадии роста и стадии синтеза продукта у разных видов микроорганизмов, что требует отдельного контроля. Во время ферментации pH ферментационной среды неизбежно изменяется, поскольку микроорганизмы используют питательные вещества и накапливают метаболические продукты. Например, при разложении мочевины концентрация NH4+ в ферментационной среде увеличивается, и pH соответственно повышается. В промышленном производстве pH часто поддерживается путем добавления буферной системы в ферментационную среду или путем периодического добавления аммиака, мочевины, карбоната аммония или карбоната кальция. В настоящее время в Китае разработаны pH-электроды для обнаружения процессов ферментации, позволяющие непрерывно измерять и регистрировать изменения pH, при этом pH-контроллеры регулируют количество добавляемой кислоты и щелочи.
3. Растворенныйкислород
Обеспечение кислородом является критическим фактором для аэробного брожения. Учитывая потребность в кислороде для окисления глюкозы, для полного окисления и разложения 1 моль глюкозы требуется 6 моль кислорода; при использовании сахара для синтеза метаболитов 1 моль глюкозы требует приблизительно 1,9 моль кислорода. Таким образом, аэробные микроорганизмы имеют высокую потребность в кислороде, но во время брожения они могут использовать только растворенный в ферментационной среде кислород, который плохо растворим в воде. При 101,32 кПа и 25 °C растворимость кислорода в воде составляет 0,26 ммоль/л. В тех же условиях растворимость кислорода в ферментационной среде составляет всего 0,20 ммоль/л, и с повышением температуры растворимость еще больше снижается. Поэтому необходимо постоянно добавлять в ферментационную среду большое количество кислорода и постоянно перемешивать ее для повышения растворимости кислорода.
4. Пенопласт
В процессе ферментации аэрация, перемешивание, микробный метаболизм и разложение определенных компонентов культуральной среды могут приводить к образованию пены. Небольшое количество пены является нормой во время ферментации, но избыточное и стойкое пенообразование вредно. Пена занимает объем ферментера, препятствуя аэрации и перемешиванию, и может даже привести к метаболическим нарушениям; поэтому ее необходимо удалять. Распространенные меры по удалению пены делятся на две категории: установка пеногасящих перегородок для принудительного разрушения пены с помощью сильной механической вибрации; использование пеногасителей. Концентрация питательных веществ в ферментационной среде, особенно соотношение углерода и азота, неорганических солей и витаминов, напрямую влияет на рост клеток и накопление продуктов метаболизма. Например, при ферментации глутаминовой кислоты изменения концентрации NH4+ влияют на метаболические пути (см. ферментация глутаминовой кислоты). Поэтому меры контроля следует применять в соответствии с конкретными условиями ферментации. Рассмотрим в качестве примера производство глутаминовой кислоты. Регулирование и контроль кислорода, температуры, pH и фосфатов в процессе ферментации осуществляется следующим образом:
① Кислород. Бактерии, продуцирующие глутаминовую кислоту, являются аэробными. Аэрация и перемешивание влияют не только на скорость использования бактериями источников азота и углерода, но и на цикл ферментации и количество синтезируемой глутаминовой кислоты. Особенно на поздних стадиях ферментации увеличение скорости аэрации благоприятно сказывается на синтезе глутаминовой кислоты.
② Температура. Оптимальная температура для роста микробного штамма составляет 30–32 ℃. Когда микробные клетки достигают стационарной фазы, соответствующее повышение температуры благоприятно сказывается на образовании кислоты. Поэтому на более поздних стадиях ферментации температуру можно повысить до 34–37 ℃.
③ pH. Оптимальный pH для ферментации бактерий, продуцирующих глутамат, составляет 7,0–8,0. Однако в процессе ферментации pH культуральной среды будет постоянно изменяться по мере использования питательных веществ и накопления продуктов метаболизма. Например, pH будет повышаться по мере использования источников азота и выделения аммиака; pH будет понижаться при использовании сахаров для образования органических кислот.
④ Фосфат. Он необходим для брожения глутаминовой кислоты, но его концентрация не должна быть слишком высокой, иначе произойдет переход к брожению валина. После брожения его обычно извлекают с помощью таких методов, как ионообменные смолы.
Метаболиты: могут быть извлечены с помощью таких методов, как дистилляция, экстракция и ионный обмен.
Сами бактерии можно отделить от культуральной среды с помощью таких методов, как фильтрация и осаждение.
Уровень продуктивности микробной ферментации в основном зависит от генетических характеристик штамма и условий культивирования. Области применения ферментационной инженерии включают:
1. Фармацевтическая промышленность
2. Пищевая промышленность
3. Энергетическая промышленность
4. Химическая промышленность
5. Сельское хозяйство: модификация генов растений; биологическая фиксация азота; генно-модифицированные инсектицидные бактерии и биологические пестициды; микробные питательные вещества.
6. Защита окружающей среды и т. д. Однако крайне важно предотвратить загрязнение в процессе микробной ферментации. Если заражены другими штаммами микроорганизмов, желаемый продукт не может быть получен.