В процессе очистки белка необходимо обратить внимание на несколько вопросов. Во - первых, уровень pH всегда контролируется в процессе очистки, чтобы избежать необратимых изменений в конфигурации белка из - за чрезмерной кислоты или щелочи. Буфер должен иметь правильное значение pH и быть безвредным для белка, при очистке белка в растениях и грибах, как правило, требуется большая буферная емкость, в это время обратите внимание на концентрацию буфера, а также обратите внимание на то, являются ли компоненты буферной жидкости подходящими, могут ли возникнуть побочные реакции и так далее. Белки, содержащие тиогликол (в которых тиогликол не связывается с дисульфидными связями), особенно подвержены окислению, поэтому необходимо поддерживать восстановительную среду. Некоторые восстановители, содержащие тиогликол, могут быть добавлены и удерживать всю систему в анаэробном состоянии, чтобы решить эту проблему, но в некоторых случаях добавление тиогликола может подавлять активность белка.

Во время процесса очистки, как правило, поддерживается низкая температура, так как в клетке присутствует белковый гидролиз, который активируется после усреднения ткани и может разлагать белки. Поэтому необходимо поддерживать низкие температуры, чтобы уменьшить действие гидролазы. Но обратите внимание, что иногда низкие температуры могут разрушить четырехступенчатую структуру некоторых ферментов. Как правило, белок более стабилен при 0°C, но ацетон карбоксилаза чувствителен к холоду и стабилен при 25°C. Некоторые ферменты должны быть стабильны при 20°C или 70°C.

Одна из самых больших проблем в процессе очистки белка заключается в том, что на протяжении всего процесса очистки белки более или менее всегда подвергаются вредному воздействию растворной среды, которая сильно отличается от их физиологического состояния. Это очень примечательно для белков, функции которых сильно контролируются в живых клетках. Напротив, некоторые белки, такие как секреционные белки, могут адаптироваться к более крупным изменениям окружающей среды без изменения их структуры и функций. Чтобы уменьшить спонтанную дегенерацию белка в разреженном водном растворе, в белковый раствор можно добавлять небольшие молекулярные вещества (например, сахар, глицерин и т. Д.) или другие белки (например, сывороточный альбумин крупного рогатого скота, желатин и т. Д.) для стабилизации белка, что является способом имитации внутриклеточной среды, которая может уменьшить вредное воздействие воды. Это также является причиной включения альбумина в качестве стабилизатора во многие генные белковые препараты. Иногда даже добавляют диметилсульфоны, диметилметиламид и т. Д., Добавление концентрации требует испытаний, как правило, на 1% - 10%, небольшое количество белков может оставаться активным в полярных средах с высокой ионной прочностью, таких как KCl, NaCl, (NH4) 2SO4 и т. Д.

Кроме того, существуют широко используемые методы, которые могут эффективно уменьшить дегенерацию белка, такие как присутствие некоторых бивалентных ионов (Mg2 +, Ca2 + и т.д.), которые способствуют стабилизации белка или белкового комплекса; При очистке ферментов можно добавлять специализированные субстраты; Иногда для удаления нежелательных ионов, особенно вредных ионов металлов, поступающих из воды, необходимо использовать комплексы (например, этилендиаминтетрауксусную кислоту). Эти методы могут использоваться в различных ситуациях.

Еще один фактор, на который следует обратить внимание, заключается в том, что даже с осторожностью в процессе очистки происходят структурные изменения в белках. Таким образом, очищенный белок, даже если его жизнеспособность в основном сохраняется, может иметь конфигурацию, отличную от естественной или функциональной. В этом случае свойства белков, обнаруженных вне организма, не всегда точно отражают поведение этих макромолекул в живом организме.

Дезинфекция, содержащая несколько субъединиц белка, является особым типом дегенерации. При очистке белка, когда измеренная энергия проявляется только одной субединицей, другие субединицы могут быть потеряны из - за незаметности. Некоторые белки имеют многофункциональные формы в организме, и их биологическая активность проявляется вместе с белками, определяемыми более чем двумя различными генетическими генами. Тогда будьте особенно осторожны при выводе полной биологической функции очищенного белка из его природы в организме. В этом случае полезно проанализировать общую динамику процесса очистки. На ранних стадиях очистки, если в качестве эталона используется общая жизнеспособность, в конце очистки, как ожидается, будет восстановлено 50% общей жизнеспособности, в то время как фактический коэффициент извлечения часто составляет всего 5 - 20%. В некоторых случаях, особенно в тех случаях, когда имеется большое количество сырья, мы можем сосредоточиться на получении образцов с высокой удельной активностью, не опасаясь урожайности.